[PORTADA]

CINÉTICA ENZIMÁTICA

Los principios generales de las reacciones químicas se aplican también a las reacciones enzimáticas. Por este motivo, antes de empezar con la cinética química, se van a repasar algunos conceptos básicos de cinética química.

A continuación, se describirán los siguientes conceptos:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CONCEPTOS BÁSICOS DE CINÉTICA QUÍMICA


En una reacción de orden cero, la velocidad de formación del producto es independiente de la concentración de sustrato: v = k

En una reacción de primer orden la velocidad de formación de los productos es directamente proporcional a la concentración del sustrato: v = k [A]. Así, en la reacción:

sacarosa + agua
glucosa + fructosa

La velocidad de hidrólisis de la sacarosa es, en todo momento, proporcional a la concentración de sacarosa. Dicho matemáticamente, donde [A] es la concentración de sacarosa a cada tiempo (t) y k es la constante de proporcionalidad. Se dice que ésta es una reacción de primer orden.

Una reacción de segundo orden es aquella en la que la velocidad de formación del producto depende

  • de la concentración de dos sustratos (como en una reacción de condensación): v = k [A1] [A2]
  • del cuadrado de la concentración de un único sustrato (reacción de dimerización): v = k [A]2

En la tabla siguiente se resumen los distintos tipos de reacción, y la forma de calcular sus parámetros cinéticos.

 
ORDEN CERO
PRIMER ORDEN
SEGUNDO ORDEN
Expresión diferencial de la velocidad
Ecuación integrada de la velocidad
[A] = -kt + [A]0
Ln[A] = -kt + Ln[A]0
Vida media (t1/2)
Representación que da lugar a una recta
[A] vs t
Ln[A] vs t
1/[A] vs t
Signo de la pendiente
negativo
negativo
positivo
Significado de la pendiente
-k
-k
k
Significado de la ordenada en el origen
[A]0
Ln[A]0
[A]0 es
b
eb
1/b

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CINÉTICA ENZIMÁTICA


La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

 

Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (Figura de la derecha). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

 

Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN


Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inical del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis (foto de la izquierda) y Maud Menten (foto de la derecha) desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.

 

Para explicar la relación oservada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre:

 

En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. Según esto, podemos afirmar que:
  • v1 = k1 [E] [S]
  • v2 = k2 [ES]
  • v3 = k3 [ES]

Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentración total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reacción) es:

[ET] = [E] + [ES]

Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

 

Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción (Figura de la derecha). Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociación (v2+ v3):

v1 = v2 + v3

Además, como [ES] es constante, la velocidad de formación de los productos es constante:

v = v3 = k3 [ES] = constante.

Como v1=v2+v3, podemos decir que:

k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

Despejando [ES], queda que: , siendo , en donde la expresión (k2+k3)/k1 se ha sustituído por KM, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicación sobre las razones que hacen de la KM un parámetro cinético importante.

Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:

v = v3 = k3 [ES] =

Para cualquier reacción enzimática, [ET], k3 y KM son constantes. Vamos a considerar dos casos extremos:

  • A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] << KM) v = (k3 [ET]/KM) [S]. Como los términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, kobs, de forma que la expresión queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la reacción es un proceso cinético de primer orden.
  • A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET]. La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (Vmax): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se encuantra unido al sustrato.

Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad, (la fórmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:

 

Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide (Figura de la derecha). En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA


La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hipérbola (Figura de la izquierda). La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

 

Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk (Figura de la derecha). Es una recta en la cual:

  • La pendiente es KM/Vmax
  • La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM
  • La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax

De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA


Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).

Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).

Cuando se conoce el peso molecular del enzima puro y el número de centros activos por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio del enzima, o sea, el número de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MOTIVOS QUE HACEN DE KM UN PARÁMETRO CINÉTICO IMPORTANTE


La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante pór múltiples razones:

  • KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si KM = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2.
  • El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad. Este hecho tiene fácil explicación si tenemos en cuenta que KM se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reacción 1 lo forma. Así, si KM es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KM es pequeña, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato).
  • La KM del sustrato natural es menor que la de los sustratos análogos. Si dos sustratos del mismo enzima tienen distinta KM, el que presente mayor KM tiene menor afinidad por el enzima, y la reacción transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor KM, salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la v = Vmax.
  • Los valores de KM de muchos enzimas son próximos a los de la concentración fisiológica de sus sustratos, de forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica.