[PORTADA]

FACTORES QUE DETERMINAN LA ESTRUCTURA DEL DNA

La estructura helicoidal del DNA se mantiene gracias a interacciones no covalentes. Por un lado, el apilamiento entre las bases adyacentes de una misma hebra favorece interacciones hidrofóbicas entre éstas, y por otro lado, cada base está unida a su pareja mediante puentes de hidrógeno. La energía libre de las interacciones no covalentes que mantienen la estructura helicoidal del DNA no es muy superior a la energía de los movimientos térmicos a temperatura ambiente, por lo que es posible desestabilizar la estructura tridimensional del DNA mediante un simple aumento de la temperatura.

Cuando se calienta un DNA de doble hebra (forma nativa) se rompen las fuerzas de unión entre las dos hebras y acaban por separarse. Por tanto, el DNA desnaturalizado es de una sola hebra. La transición entre el estado nativo y el desnaturalizado se conoce como desnaturalización. En determinadas condiciones, una disolución de DNA monocatenario (desnaturalizado), puede volver a formar el DNA nativo (de doble hebra). Este proceso recibe el nombre de renaturalización del DNA. Cuando el DNA renaturalizado se forma a partir de moléculas de DNA de distinto origen, o entre una molécula de DNA y otra de RNA, la renaturalización se conoce como hibridación.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DESNATURALIZACIÓN DEL DNA


Cuando se rompen las fuerzas de unión entre las dos hebras del DNA, éstas acaban por separarse. Por tanto, el DNA desnaturalizado es de una sola hebra. La transición entre el estado nativo y el desnaturalizado se conoce como desnaturalización.

La forma más corriente de desnaturalizar el DNA es por calentamiento. Otro agente desnaturalizante es el pH elevado porque cambia la carga de algunos grupos que forman parte de los puentes de hidrógeno. En agua destilada (con una fuerza iónica muy reducida) se produce la separación de las hebras. Este fenomeno se debe a que en agua muy pura, la fuerte repulsión entre las cargas negativas de los grupos fosfato no es contrarrestada por los correspondientes contraiones (Na+, Mg+2).

La gráfica que representa la medida de A260 en función de la temperatura se llama curva de fusión del DNA (Figura inferior). Esta curva presenta las siguientes características:

1.- La A260 permanece constante hasta temperaturas bien por encima de las fisiológicas. En este intervalo, la molécula está en forma de doble hebra.

2.- El aumento de A260 tiene lugar en un estrecho rango de temperaturas (6-8 ºC). La A260 empieza a aumentar cuando comienzan a romperse las uniones entre las bases en varios segmentos de la molécula. El número de PB que se rompen aumenta con la temperatura, y con ella la A260. Al final del tramo ascendente, las dos hebras se mantienen juntas por unos cuantos PB.

3.- La A260 máxima es aproximadamente un 37% mayor que el valor inicial, y corresponde al estado en que las dos hebras están completamente separadas.

Un parámetro muy útil para caracterizar la evolución de la fusión es la temperatura a la que el aumento de la A260 ha llegado a la mitad de su camino. Esta temperatura se llama temperatura de fusión (Tm). Se ha comprobado que la Tm aumenta con el contenido de G+C (Figura de la derecha). Como el par de bases G-C está unido por tres puentes de hidrógeno (a diferencia del par A-T que sólo presenta 2) se requiere una temperatura más alta para desnaturalizarlo.

Temperatura de fusión del DNA (Tm)
Dependencia de Tm con el contenido en G+C del DNA

 

Los reactivos que incrementan la solubilidad de las bases (como el etanol) disminuyen la Tm, ya que reducen la interacción hidrofóbica que las mantiene unidas (Figura de la izquierda).

De esto se deduce que tanto los puentes de hidrógeno como las interacciones hidrofóbicas cooperan para formar una estructura estable. Si se reduce o elimina cualquiera de estas interacciones, la estabilidad disminuye y la Tm es menor.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

RENATURALIZACIÓN DEL DNA


4Una disolución de DNA desnaturalizado puede ser tratada de forma que recupere su configuración nativa. El proceso se llama renaturalización, y se obtiene un DNA renaturalizado. Para que tenga lugar la renaturalización deben cumplirse dos requisitos:

  • La concentración salina debe ser alta ([NaCl] entre 0,15 y 0,5 M) para eliminar la repulsión entre los grupos fosfato de las dos hebras.
  • La temperatura deber ser lo suficientemente elevada como para romper los puentes de hidrógeno intracatenarios producidos al azar en el DNA monocatenario, y lo suficientemente baja como para estabilizar los apareamientos correctos entre las bases de hebras distintas. La temperatura óptima de renaturalización es de unos 20 a 25 ºC por debajo de la Tm.

La renaturalización es un fenómeno de unión al azar, y por tanto la molécula de DNA renaturalizada no contiene las hebras originales. Si mezclamos un DNA marcado con el isótopo 15N con otro que contenga el isótopo normal 14N y los desnaturalizamos, durante la renaturalización se forman 3 tipos de moléculas de doble hebra: un 25% con 14N en las dos hebras, un 25% con 15N en las dos hebras y un 50% con una hebra 14N y otra 15N.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

HIBRIDACIÓN DEL DNA


Cuando el DNA renaturalizado se forma a partir de moléculas de DNA de distinto origen la renaturalización se conoce como hibridación. Una característica importante de la hibridación es que no sólo se puede producir entre dos DNA distintos, sino también entre DNA y RNA (Figura de la derecha), siempre que sus secuencias de nucleótido sean complementarias.