Plegamiento y estabilidad de proteínas de membrana. Ingeniería y diseño de motivos estructurales

(A. R. Viguera)

Durante los últimos años, nuestra investigación se ha centrado en el estudio del plegamiento de proteínas o fragmentos solubles. Nuestro objetivo más inmediato es ahora invertir la experiencia adquirida con estos sistemas más sencillos en el estudio de motivos de proteínas de membrana, como una primera aproximación al problema del ensamblaje de complejos lípido-proteína. En concreto, pretendemos caracterizar los diversos equilibrios conformacionales que establecen polipéptidos de interés en presencia de bicapas lipídicas

Referencias:

“Hydrogen-exchange stability analysis of Bergerac-Src homology 3 variants allows the characterization of a folding intermediate in equilibrium” A.R. Viguera y L. Serrano. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 5730-5735 (2003).

“Diagnosis of Parietaria judaica pollen allergy using natural and recombinant Par j 1 and Par 2 allergens” R. González-Rioja, A. Ferrer, M.C. Arilla, I. Ibarrola, A.R. Viguera, C. Andreu, A. Martinez and J.A. Asturias Clin. Exper. Allergy 37, 243-250 (2007).

Estudios estructurales de biomoléculas por espectroscopia IR

(J. L. Arrondo)

Nuestro laboratorio fue pionero, en los años ochenta, en la aplicación de la espectroscopía infrarroja al estudio de la estructura de lípidos y proteínas. En la actualidad estamos desarrollando la nueva tecnología de la espectroscopía IR bidimensional aplicada al análisis de la estructura y cambios conformacionales tanto en proteínas como lípidos y sus complejos.

Algunos de los sistemas a los que dedicamos más atención actualmente incluyen:

• Estudio de mezclas de esfingomielina-colesterol
• Proteínas de membrana y lipoproteínas
• Amiloidogénesis
• Interacciones proteína-DNA.

Referencias:

- "Structure and dynamics of membrane proteins as studied by infrared spectroscopy". J.L.R. Arrondo y F.M. Goñi. Prog. Biophys. Mol. Biol. 72, 367-405 (1999).

- “Structural analysis and assembly of the HIV-1 Gp41 amino-terminal fusion peptide and the pretransmembrane amphipathic-at-interface sequence” M. Lorizate, I. de la Arada, N. Huarte, S. Sánchez-Martínez, B.G. de la Torre, D. Andreu, J.L.R. Arrondo and J.L. Nieva Biochemistry 45, 14337-14346 (2006).

Papel de las membranas celulares en la patogénesis bacteriana

(H. Ostolaza, Félix. M. Goñi)

Nuestro grupo viene estudiando los últimos años el fenómeno de la interacción de una toxina patogénica, la α-hemolisina de Escherichia coli, con eritrocitos y membranas modelo. Es éste un ejemplo de proteína que se sintetiza inicialmente como una proteína soluble, pero que, al encuentro con una membrana, se inserta en ella, actuando a partir de ese momento como una proteína intrínseca. Nuestro esfuerzo se está centrando en estudiar los requerimientos estructurales de la toxina para que tenga lugar esta transformación entre estados soluble-insertado, así como los parámetros que podrían modular la interacción con la membrana diana. Más recientemente hemos ampliado el objeto de nuestro trabajo para incluir otra toxina de la familia RTX, la “toxina adenilato ciclasa” de Bordetella pertussis.

Referencias:

“Membrane insertion of Escherichia coli α-Hemolysin is independent from membrane lysis” L. Sánchez-Magraner, A.L. Cortajarena, F.M. Goñi and H. Ostolaza J. Biol. Chem. 281, 5461-5467 (2006).

“The calcium-binding C-terminal domain of Escherichia coli α-haemolysin is a major determinant in the surface-active properties of the protein” L. Sánchez-Magraner, A.R. Viguera, M. García-Pacios, M.P. Garcillán, J.L.R. Arrondo, F. de la Cruz, F.M. Goñi and H. Ostolaza J. Biol. Chem 282, 11827-11835 (2007).

Mecanismo de acción de toxinas peptídicas que actúan a nivel de membrana

(Juan Manuel González Mañas)

Nuestras investigaciones se centran en la interacción de la equinatoxina-II con membranas celulares y membranas modelo. La equinatoxina-II es una toxina que forma poros en la membrana, y es producida por la anémona Actinia equina. Mediante mutagénesis dirigida se están diseñando mutantes que nos ayuden a identificar aquellos residuos implicados directamente en el proceso de inserción. Por otra parte, estamos investigando los parámetros biofísicos de la membrana que favorecen esta interacción, y en especial, la coexistencia de fases lipídicas en el seno de la bicapa.

Referencias:

"Lipid phase coexistence favors membrane insertion of equinatoxin-II, a pore-forming toxin from Actinia equina". Barlic, A, Gutiérrez-Aguirre, I., Caaveiro, J. M. M., Cruz, A., Ruiz-Argüello, M. B., Pérez-Gil, J. and González-Mañas, J. M. J. Biol. Chem. 279: 34209-34216 (2004).

"Pore formation by equinatoxin, a eukaryotic pore-forming toxin, requires a flexible N-terminal region and a stable ß-sandwich" K. Kristan, Z. Podlesek, V. Hojnik, I. Gutiérrez-Aguirre, G. Guncar, D. Turk, J.M. González-Mañas, J.H. Lakey, P. Macek and G. Anderluh J. Biol. Chem. 279, 46509-46517 (2004).

Relaciones inter-dominios en proteínas integrales de membrana

(I. Alkorta, Félix. M. Goñi)

El propósito de este proyecto es la elucidación del papel de los diferentes elementos proteicos que constituyen el aparato de conjugación bacteriana del plásmido R388. En particular, estamos interesados en la proteína de membrana TrwB. Esta proteína es el primer miembro de la familia de proteínas acopladoras purificado y está implicada en el paso del DNA de la célula donante a la receptora. La elucidación de su papel en el proceso de conjugación contribuirá a solucionar el problema de la resistencia a antibióticos mostrada cada vez más frecuentemente por distintas cepas bacterianas. (En colaboración con F. de la Cruz, Universidad de Cantabria).

Referencias:

“Role of the transmembrane domain in the stability of TrwB, an integral protein involved in bacterial conjugation” I. Hormaeche, I. Iloro, J.L.R. Arrondo, F.M. Goñi, F. de la Cruz and I. Alkorta J. Biol. Chem. 279, 10955-10961 (2004).

"The transmembrane domain provides nucleotide binding specificity to the bacterial conjugation protein TrwB” I. Hormaeche, R.L. Segura, A.J. Vecino, F.M. Goñi, F. de la Cruz and A. Alkorta FEBS Lett. 580, 3075-3082 (2006).

Mecanismos de la fusión de membranas inducida por virus

(J. L. Nieva)

Se intenta determinar el mecanismo molecular por el cual las glicoproteínas de la membrana de algunos virus (HIV, Ebola) inducen la fusión de las membranas vírica y celular. Se han desarrollado herramientas de predicción para la detección de los dominios que se integran en la membrana blanco. Se intenta averiguar su comportamiento como determinantes antigénicos y desarrollar agentes inhibidores que boqueen su interacción desestabilizante. Una derivación de estos estudios consiste en la caracterización de dominios similares que podrían estar implicados en la penetración infectiva de la proteína del prión. Por otra parte, se investiga el mecanismo de permeabilización de las membranas celulares promovida por determinados productos víricos (viroporinas), durante la infección. (Estudios sobre viroporinas en colaboración con L. Carrasco, CBM, Madrid).

Referencias:

“Recognition and blocking of HIV-1 gp41 pre-transmembrane sequence by monoclonal 4E10 antibody in a raft-like membrane environment” M. Lorizate, A. Cruz, N. Huarte, R. Kunert, J. Pérez-Gil and J.L. Nieva J. Biol. Chem. 281, 39598-39606 (2006).

“Plasma membrane-porating domain in poliovirus 2B protein. A short peptide mimics viroporin activity” V. Madan, S. Sánchez-Martínez, N. Vedovato, G. Rispoli, L. Carrasco and J.L. Nieva J. Mol. Biol. 374, 951-964 (2007).

.Membranas mitocondriales, apoptosis y cáncer

(G. Basañez)

Durante la apoptosis, las membranas mitocondriales sufren importantes cambios de permeabilidad y morfología. Los principales componentes implicados en estos procesos son, por un lado, los miembros de la familia Bcl-2 (con la asistencia de un número creciente de proteínas, incluyendo a p53), y por otro, los miembros de la maquinaria de fisión mitocondrial. Sin embargo, a pesar de su importancia, los mecanismos subyacentes no han sido aún totalmente esclarecidos. Dada la complejidad inherente de los sistemas celulares, nuestros estudios se centran en establecer sistemas reconstituidos in vitro que nos permitan dilucidar los mecanismos de estos procesos a nivel molecular, utilizando un enfoque multidisciplinar fundamentado en técnicas biofísicas. Los avances logrados están encaminados, a su vez, a facilitar progresos en la lucha contra el cáncer.

Referencias:

"Calpain I induces cleavage and release of apoptosis-inducing factor from isolated mitochondria" B.M. Polster, G. Basañez, A. Etxebarria, J.M. Hardwick and D.G. Nicholls J. Biol. Chem. 280, 6447-6454 (2005).

“The N-terminal domain of Bcl-xL reversibly binds membranes in a pH-dependent manner” G.R. Thuduppathy, O. Terrones, J.W. Craig, G. Basañez and R.B. Hill Biochemistry 45, 14533-14542 (2006).

Cristalografía de Rayos X y cristalización de proteinas y virus

(D.M A. Guérin)

El conocimiento de las estructuras de una macromolécula de interés biológico (enzimas, receptores, y grandes agregados moleculares como virus) permite interpretar el mecanismo de las funciones bioquímicas asociadas a ellas. La cristalografía de proteínas es en la actualidad la técnica más desarrollada y poderosa para determinar las estructuras atómicas y esta técnica es la empleada en nuestro grupo para estudiar una variada gama de macromoléculas. En la actualidad estamos trabajando en la resolución de las estructuras de varias proteínas de interés en la Unidad de Biofísica (varios mutantes de GroEL, DnaK y TrwB) y también mantenemos colaboraciones con centros nacionales y extranjeros en otros proyectos cristalográficos (virus del triatoma TrV, AchR entre otros). Paralelamente a estos trabajos cristalográficos, estamos desarrollando nuevos dispositivos experimentales para caracterizar mediante técnicas ópticas, de rayos x y espectroscópicas, el proceso de nucleación durante la cristalización de proteínas.

Referencias:

“Structure of armadillo ACBP: a new member of the acyl-CoA-binding protein family” M.D. Costabel, M.R. Ermácora, J.A. Santomé, P.M. Alzari and D.M.A. Guérin Acta Cryst. F62, 958-961 (2006).

“Crystal structure of the temperature-sensitive and allosteric-defective chaperonin GroELE461K” A. Cabo-Bilbao, S. Spinelli, B. Sot, J. Agirre, A.E. Mechaly, A. Muga and D.M.A. Guérin J. Struct. Biol. 155, 482-492 (2006).

Identificación y caracterización de proteínas y lípidos asociados a reguladores de la excitabilidad celular

(A. Villarroel)

Entre los canales iónicos, los selectivos a potasio son, con diferencia, el grupo más diverso. Juegan un papel clave en procesos tales como la respuesta inmune, diferenciación celular, excitabilidad, muerte celular, etc. Se conocen más de 60 genes para canales de potasio en el genoma humano, lo que unido a que hasta cuatro subunidades distintas pueden combinarse para formar un canal, da lugar a un número elevado de variantes. A pesar de esta impresionante redundancia en la función "permear potasio", mutaciones en algunas subunidades causan enfermedades hereditarias, lo que indica que el resto de canales no pueden suplirlos. Estas enfermedades se denominan canalopatías. En la actualidad, se conocen alrededor de diez canalopatías de potasio, y cuatro de ellas se deben a mutaciones en miembros de la familia KCNQ, cuyo producto génico son los canales Kv7.1-Kv7.5.

Nuestra investigación se centra en el estudio molecular de estas proteínas, que controlan la excitabilidad celular. En humanos, mutaciones en estas proteínas provocan arritmia, epilepsia o sordera, dependiendo de la isoforma afectada y de su distribución tisular. Nuestro objetivo es la identificación de la red de proteínas asociadas a estos canales, analizando las consecuencias fisiológicas de estas interacciones mediante estudios de mutagénesis-función, por técnicas electrofisiológicas y de imagen, bioquímicas y biofísicas de alta resolución. Asimismo, queremos definir el papel que juegan los lípidos en la regulación de estos canales. Actualmente, estamos definiendo las regiones del canal implicadas en la biogénesis, ensamblaje, inserción en la membrana y localización subcelular, así como en la regulación por lípidos que actúan como segundos mensajeros. Queremos identificar las proteínas y lípidos que interaccionan específicamente con cada uno de estos dominios, que pueden representar dianas para el desarrollo de fármacos terapéuticos. A más largo plazo, nuestro objetivo es resolver la estructura tridimensional de estos macro-complejos. Como etapa intermedia para su futura cristalización, vamos a investigar nuevas estrategias de alto rendimiento para la producción de grandes cantidades de macro-complejos solubles correctamente plegados.

Referencias:

"The Identification and Characterization of a Non-Continuous Calmodulin Binding Site in Non-Inactivating Voltage-Dependent KCNQ Potassium Channels". Yus-Nájera E., Santana-Castro I. and Villarroel A. J. Biol Chem. 277:28545-28553 (2002).

"Three mechanisms underlie KCNQ2/3 heteromeric potassium M-channel potentiation" A. Etxeberria, I. Santana-Castro, M.P. Regalado, P. Aivar and A. Villarroel J. Neurosci. 24, 9146-9152 (2004).