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SERVICIO GENERAL DE GENÓMICA

UNIDAD DE EXPRESIÓN GÉNICA

 

Requisitos de las muestras

 

 

 

Recomendaciones básicas para el manejo de RNA

 

El RNA es un material extremadamente sensible y deben tomarse las máximas precauciones para evitar la contaminación con ribonucleasas (RNasas) y su degradación. Las RNasas son unas enzimas muy estables y activas que hidrolizan el RNA y no requieren de cofactores para su función. Las RNasas son muy difíciles de inactivar, soportan el autoclavado y son insensibles a los métodos estándar para la inactivación de proteínas. Es importante trabajar en un ambiente libre de RNasas, y debe tratarse el material para su eliminación. Las siguientes recomendaciones ayudan a prevenir la contaminación de RNasas:

 

  • Utilizar guantes durante todo el proceso de manejo de muestras, material fungible y de vidrio, y extracción de RNA. Las RNasas están presentes en grandes cantidades en la piel y es la mayor vía de contaminación de RNasas. Durante la extracción intentar trabajar lo más rápido posible para minimizar la exposición con RNasas y evitar la degradación del RNA.
  • Opcional: Tratar superficies, extremos de las pipetas y gradillas con RNaseZap (AMBION) u otra solución descontaminante de RNasas. Utilizar pipetas específicas para el manejo de RNA.
  • Mantener la muestra de RNA siempre en hielo o bloque frío, al menos que esté disuelta en un disolvente orgánico.
  • Utilizar material plástico desechable (tubos, puntas de pipetas) estéril y certificado libre de RNasas.
  • El material de vidrio debe incubarse en un horno a 240°C toda la noche. Los tapones de plástico, y otro tipo de material de plástico no desechable como cubetas de electroforesis, probetas, vasos de precipitados, debe lavarse con 0.1M NaOH, 1mM EDTA durante 5 minutos, y enjuagarse con agua MilliQ libre de RNasa. Alternativamente, material de plástico resistente al cloroformo, puede enjuagarse con cloroformo.
  • El agua y las soluciones (excepto aquellas que contengan Tris-base) deben tratarse con DEPC* (dietil pirocarbonato) 0,1 % (v/v en agua destilada). Durante la preparación de la solución de 0,1 % DEPC mezclar vigorosamente la solución durante 1 minuto, incubar a temperatura ambiente durante toda la noche en la campana de extracción, y autoclavar la solución antes de su uso para inactivar el DEPC. Si la solución contiene Tris-base, preparar la solución con agua-DEPC autoclavaza.
  • Precaución: El DEPC es tóxico y posible carcinógeno. Utilizar guantes y realizar todo el proceso en una campana de extracción hasta su inactivación por autoclavado.
  • Se recomienda resuspender el RNA en agua ultrapura tratada con DEPC o libre de RNasas.

 

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Requisitos de Calidad de las muestras

 

Uno de los pasos críticos para el éxito de los análisis realizados mediante PCR a Tiempo Real y la tecnología de microarrays es la calidad de las muestras de RNA. La calidad del RNA se mide en base a tres parámetros básicos:

 

  • Pureza: La contaminación de la muestras con impurezas orgánicas e inorgánicas (p.ej. fenol, cloroformo), y proteínas afecta de forma significativa la sensibilidad y especificad del resultado. Para determinar el grado de pureza del RNA se determina la relación de absorbancia A260/280 y A260/230, que debe ser = 1,8.
  • Integridad: La absorbancia a 260 nm y la relación A260/280 sólo nos da una indicación de la cantidad de RNA y del grado de contaminación de impurezas orgánicas e inorgánicas, pero no nos dice nada sobre el nivel de degradación de RNA. Existen dos métodos para determinar el grado de degradación del RNA:
    • Relación entre las bandas ribosomales 28S y 18S que se observan en un gel de agarosa como bandas discretas y cuya relación 28S/18S en un RNA íntegro es cercano a dos. Se recomienda una relación 28S/18S = 1,2.
    • RIN: RNA Integrity Number, es un número que aplica el algoritmo del software del Bioanalizador 2100 Bioanalyzer de Agilent Technologies y que es un indicador del grado de degradación de la muestra de RNA. Un RNA intacto tiene un RIN 9-10, mientras que un RNA degradado tendría un RIN <6. Para las aplicaciones de PCR a tiempo Real y microarrays se recomienda un RIN mínimo de 7, aunque depende del tipo de muestra.
  • Contaminación de DNA genómico: Las técnicas de análisis de expresión génica mediante PCR a tiempo real o microarrays son técnicas extremadamente sensibles a la contaminación de DNA genómico de la muestra de RNA. La contaminación de DNA puede afectar de forma significativa a la sensibilidad y especificidad del resultado de expresión génica. El mejor método para evitar la contaminación de DNA genómico es el utilizar un método de extracción que combine al extracción orgánica en fenol (Trizol Reagent) y la posterior purificación en columna. Existen kits de purificación en columna que incluyen un pretratamiento en columna con DNasa y posterior elución del RNA. En aquellos casos en los que la muestra contenta un grado de contaminación inaceptable para la aplicación de microarrays o PCR a tiempo Real con SYBR Green (especialmente importante) debe tratarse la muestra con DNasa (QIAGEN o AMBION) y repurificar en columna tras el tratamiento. Es muy importante eliminar totalmente la DNasa ya que inactiva la reacción de retrotranscripción requerida en la síntesis de cDNA o cRNA.
  • DNA-free: a new method to remove DNA, AMBION
  • Avoiding DNA contamination in RT-PCR
  • RNase free DNase set, QIAGEN

 

 

Es esencial que las todas las muestras del análisis tengan grados de pureza (A260/280) e integridad (28S/18S y/o número RIN) comparables.

 

Para más información sobre la calidad del RNA y cómo analizarla lea las siguientes notas de AMBION:

 

  1. Assessing RNA quality: The Good, The Bad and the Ugly
  2. Is your RNA intact? Methods to check RNA integrity: AMBION TechNote 8(3)
  3. Assessing RNA quality: AMBION TechNote 11(1)
  4. Determinants of RNA integrity and Purity: AMBION TechNote 11(2)

 

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Recomendaciones para la extracción del RNA

 

Se recomienda el uso de muestras frescas para la obtención del RNA. Para la extracción de RNA a partir de tejidos, congelar el tejido en nitrógeno líquido inmediatamente después de su obtención. El tejido así congelado puede mantenerse a -80°C hasta la extracción del RNA. Para la extracción, trocear y pesar el tejido sin descongelar, mantenerlo en hielo seco hasta su homogenización en la solución de lisis. Otra solución para acumular tejido hasta el momento de la extracción, es utilizar una solución estabilizadora de RNA como el RNAlater de AMBION (Cat #AM7020, AM7024) o QIAGEN (Cat # 76104, 76106). Seguir las instrucciones del fabricante.

 

Para el análisis de expresión génica es imprescindible el procesamiento de las muestras control o referencia y experimental en paralelo y siguiendo exactamente el mismo procedimiento.

 

Las técnicas de microarrays y de PCR a tiempo real son técnicas extremadamente sensibles que requieren de muestras de gran calidad e integridad, libres de impurezas y DNA genómico. Se recomiendan los siguientes métodos de extracción y síntesis de cDNA:

 

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Métodos de extracción de RNA:

 

  • Para la extracción del RNA a partir de tejidos, incluidas células sanguíneas, se recomienda una combinación de extracción orgánica con Trizol Reagent (Invitrogen, Cat.# 15596-018) seguido de una purificación en columna (RNeasy Mini kit, QIAGEN, Cat # 74104).
  • Para células en suspensión o cultivos celulares la extracción con RNeasy Mini kit (QIAGEN) es suficiente.
  • En el caso de muestras para PCR a tiempo Real también ha sido validado el sistema de purificación en columna RNAqueous-4PCR kit de AMBION (Cat # AM1914), obteniéndose un RNA libre de contaminación de DNA genómico.
  • Para la extracción de RNA a partir de pequeñas cantidades de muestras, por ejemplo obtenidas a partir de microdisección por láser se recomiendan dos métodos ya validados para PCR a tiempo real: Absolutely RNA Nanoprep kit de Stratagene (Cat # 400753); y RNAqueous Mikro kit de AMBION ( Cat # AM1931) combinado con LCM Staining kit (AMBION, Cat # AM1935).
  • Para la extracción de RNA para el análisis de microRNAs mediante el sistema de microarrays de miRNA, Agilent Technologies recomienda tres métodos de extracción: miRNeasy Mini kit de QIAGEN (CAT # 217004), mirVana RNA isolation kit de AMBION (CAT # AM1560, AM1561), o Trizol Reagent de Invitrogen (Cat.# 15596-018). Agilent recomienda seguir las instrucciones de los fabricantes para la extracción de RNA total.

 

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Extracción de DNA para el sistema de microarrays de aCGH de Agilent Technologies:

 

  • Agilent Technologies recomienda el kit DNeasy Blood & Tissue kit de QIAGEN (Cat # 69504).
  • Para la extracción de DNA genómico a partir de muestras fijadas y emparafinadas (FFPE) seguir las instrucciones del protocolo de aCGH de Agilent.

 

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Métodos para la síntesis de cDNA a partir de RNA total para el análisis de expresión génica mediante PCR a tiempo real.

 

  • La unidad ha validado con éxito tres kits de síntesis de cDNA: High-capacity cDNA Reverse Transcription kit, de Applied Biosystems (Cat # 4368814, #4374966 with RNAse Inhibitor); High-capacity RNA-to-cDNA Master Mix de Applied Biosystems (Cat # 4390778, 200rx; # 4390777, 50rx) y SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR, de Invitrogen (Cat # 11904-018). En este último caso se recomienda el uso de random primers.

 

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Recomendaciones para el envío de muestras

 

Las muestras deben enviarse junto con el formulario de solicitud de servicio debidamente cumplimentado. En el caso de proyectos de microarrays es importante adjuntar la mayor información posible sobre el proyecto.

 

Las muestras deben ir en tubos de 1,5 ml correctamente identificados con el nombre de muestra que se ha indicado en el formulario de solicitud, y disueltas en agua libre de RNasas o tratada con DEPC. Las muestras de RNA deben enviarse congeladas en nieve carbónica o hielo seco. Respecto al cDNA también se recomienda enviarlo congelado.

 

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Cantidades requeridas

 

  • 2100 Bioanalyzer:
    • Se requiere el envío de 1,5 µl a una concentración de 25-500 ng/µl para RNA total y 25-250 ng/µl de mRNA en el caso de RNA 6000 Nano Chips.
  • PCR a tiempo Real:
    • Se migra 1 µl de cDNA por reacción, y las muestras se migran por triplicado. Enviar suficiente muestra para el total de reacciones: 3 x n° genes a analizar. El cDNA debe tener una concentración de 10-100 ng/µl (aproximadamente, guiándonos por la concentración de RNA). En el caso de Sybr Green es necesario realizar una curva estándar con 4 diluciones de una muestra patrón, preferiblemente del mismo tejido y tipo de extracción que las muestras a analizar, y debe estar a una concentración superior a 500 ng/µl. El RNA empleado para la síntesis del cDNA debe tener una relación A260/280 entre 1.8-2.1. En el caso de SYBR Green y cuando el amplicón no esté diseñado en exones diferentes (genes de un único exon), se recomienda el tratamiento con DNasa de la muestra y el envío de una muestra de RT minus, reacción de cDNA pero sin añadir el enzima, para comprobar si hay contaminación de DNA genómico y si daría lugar a un amplicon inespecífico. SE RECOMIENDA INCLUIR UNA FOTO DE GEL DE AGAROSA O DE 2100 BIOANALYZER.
  • Servicio de microarrays. Para más información vea el apartado correspondiente de los servicios ofertados.
    • Expresión Génica:
      • Se requieren 1 µg RNA total para marcaje de un color y de 2 µg en el caso de marcaje de dos colores, a una concentración de 200 ng/µl, disuelto en agua ultrapura libre de RNasas. Enviar las muestras correctamente identificadas en tubos eppendorf 1.5ml, congeladas con hielo seco. Requerimientos mínimos de calidad: A260/280 ≥ 1,8; 28S/18S ≥ 1,2; RIN: 7.
    • Para las demás aplicaciones del servicio de microarrays (aCGH, ChIP-on-chip, Metilación DNA, miRNAs) consulte con el personal técnico de la unidad.

 

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